Pochi anni dopo il suo completamento, l’infermeria fu ampliata con l’aggiunta di un altro piano. Mentre le dimensioni dell’ospedale erano adatte alle esigenze quotidiane, non erano adatte nei periodi di emergenza. La Santa Infermeria funzionò come un normale ospedale fino al 1575, quando La Sacra Infermeria di La Valetta fu completata. A Birgu, apparte della Santa Infermeria, i cavalieri italiani tenevano un piccolo ospedale nel loro stesso territorio. Questo ospedale fu mantenuto fino a quando i cavalieri si trasferirono nei loro nuovi quartieri a La Valletta. Dopo la vittoria cavalleresca del Grande Assedio sui Turchi nel 1565, l’Ordine decise di costruire una nuova città fortificata a guardia del porto principale delle Isole. E così fu pianificata una nuova Santa Infermeria, il sito scelto è il lato sud-orientale di La Valletta. L’edificio, iniziato nel 1574, consisteva originariamente di un lungo reparto. Fu, successivamente, ampliato nel 1583 con l’aggiunta di un nuovo blocco, e rimodellato nel 1662 e nel XVIII secolo.

Il numero di letti variava nel corso dei secoli. Alla fine del XVIII secolo, c’erano 554 letti singoli che potevano essere aumentati a 900 in caso di emergenza. La maggior parte dei letti (370) erano dotati di tettoie di varie tonalità di colore e materassi di lana. I reparti dell’ospedale erano aperti a tutti, membri dell’Ordine, civili o schiavi. C’erano anche sistemazioni per accogliere i trovatelli. La Sacra Infermeria di La Valletta fu uno dei migliori ospedali preparati in Europa. Essa fu descritta favorevolmente da un numero di visitatori stranieri delle Isole durante il XVII e l’inizio del XVIII secolo. Per esempio, il reverendo Henry Teonge nel 1675 descrisse l’ospedale come così vasto che 12 uomini possono camminare tranquillamente con un petto in mezzo a esso; e i letti sono su ciascun lato, in piedi su quattro pilastri di ferro con tende bianche e vollands e coprendo estremamente pulito, e mantenuti puliti e carini; tutti gli ammalati sono serviti da un piatto d’argento. Una descrizione dettagliata contemporanea delle sale fu fatta nel 1687 dal sig. G. Wood.

Questa descrizione delle corsie con baldacchini su letti a baldacchino conferma la raffigurazione delle corsie rappresentate in un’incisione del 1588, probabilmente fatta da Filippus Thommasinus e della pittura del XVIII secolo del “Beato Geraldo” dipinta da Favray e conservata al Museo Nazionale di Belle Arti a La Valetta. Le rappresentazioni del diciassettesimo secolo dei reparti della Sacra Infirmeria, tra cui si trova un’incisione tedesca del 1650 di Christian von Osterhausen e un probabile dipinto di Mattia Preti del “Beato Geraldo” tenuto nell’ex Infermeria, mostrano arrangiamenti leggermente diversi in cui i letti mantengono i loro baldacchini.Verso la fine del diciottesimo secolo, fu un declino negli affari generali dell’Ordine compresa la gestione della Santa Infermeria. Nel 1786 l’ospedale fu descritto negativamente da John Howard. Esso scrisse che “il soffitto è alto, ma essere di legno ora è diventato nero; le finestre sono piccole e le pareti sono appese a quadri polverosi, questa nobile sala non fa che apparire cupa .... Tutti i reparti erano sporchi e offensivi, tanto che era necessario usare la profumazione e il medico doveva tenere il fazzoletto in faccia mentre faceva il suo giro ... i pazienti .... erano serviti dalle persone più sporche, lacere, insensibili e disumane che avessi mai visto.

Il declino della Sacra Infermeria continuò durante l’interludio francese di due anni tra il 1798 e il 1800. I francesi fondarono il loro primo ospedale a Mdina esattamente nel primo giorno della loro occupazione, ma quattro giorni dopo fu emesso un ordine per prenotare la Sacra Infermeria, ribattezzata con il nome Grand Hopital, per l’uso esclusivo delle loro truppe. I pazienti civili furono trasferiti prima nella Casa delle Alunne e successivamente nel Monastero e nella Chiesa di Santa Maria Maddalena che divenne l’Hopital Civil (L’Ospedale Civile). In questo modo, la Santa Infermeria iniziò la sua fase di ospedale militare, una funzione che svolse anche sotto il dominio britannico fino al 22 dicembre 1919 quando fu ceduta al governo civile. In seguito fu stata utilizzata per una varietà di scopi, fino a quando nel 1978 fu stata convertito nel Mediterranean Conference Centre.